荧光标记原理及影响荧光标记的因素--干活科普

产品名称：荧光标记原理及影响荧光标记的因素--干活科普

产品描述：

荧光标记所依赖的化合物称为荧光物质。荧光物质是指具有共轭双键体系化学结构的化合物，受到合适的激发光照射时，可跃迁成为激发态，当从激发态恢复至基态时，发出荧光。利用荧光物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上，可利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。

某些小分子荧光素或生物素等经过活化，在一定的pH及温度范围内，可以专一地与蛋白或者多肽上的伯胺基反应，形成稳定的酰胺键，从而实现标记物与蛋白或抗体的偶联。另外一些荧光素经过活化后，在一定条件下，可以与蛋白或抗体自身的，或额外引入的其他化学反应基团发生专一性反应，形成稳定的化学键，从而实现标记物与蛋白或抗体的偶联。

所以总结起来，荧光标记的原理是：活化的荧光素在一定的条件内，和蛋白或抗体上的活性基团发生反应，从而实现标记物与蛋白或抗体的偶联。荧光标记技术具有无放射物污染、操作简便等优点，这使得荧光标记的应用日趋广泛。

二、影响荧光标记的因素

1、无机盐组分干扰

蛋白质内含有干扰标记的组分，如甘氨酸、咪唑、Tris，叠氮化钠、硫柳汞、Proclin等，会影响后标记效果，如果待标记的蛋白样本中含有上述成分，则需要在标记前通过透析、脱盐或多次超滤方式除去干扰标记的成分。

2、载体蛋白干扰

初始蛋白中含有载体蛋白如BSA、明胶等，有些蛋白保存过程中也会加入BSA作为蛋白质保护剂。这些载体蛋白也会和荧光素结合，从而影响标记过程中染料分子与目的蛋白的结合，因此如果待标记的蛋白样本中混有载体蛋白，则需要使用亲和纯化或其他色谱方法除去干扰成分，或者配合使用BSA去除试剂盒产品，使用后准确定量蛋白质浓度再进行标记。 

3、实验操作不恰当

如染料和蛋白未完全混匀，或其他误操作等，不恰当的操作同样影响后的荧光标记结果，建议严格按照说明书操作流程进行标记。

4、初始蛋白浓度不准确

标记前，需要控制蛋白浓度，再根据公式进行计算染料使用量。若初始蛋白浓度不准确，则无法得到合适的染料使用量，容易出现标记不充分或过度标记的情况，从而影响之后的实验结果。

5、染料保存不恰当

部分染料易受潮水解失效，需要与干燥剂一同放置于-20°C或-80°C保存。为防止水蒸气冷凝到染料中，实验前将其移至室温平衡再进行后续操作。

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